Klebende Kryogelpartikel zur Überbrückung enger und unregelmäßiger Gewebedefekte

May 15, 2023

Military Medical Research Band 10, Artikelnummer: 15 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Rekonstruktion geschädigten Gewebes erfordert sowohl eine oberflächliche Blutstillung als auch eine Gewebeüberbrückung. Gewebe mit Schäden aufgrund eines physischen Traumas oder chirurgischer Behandlungen können willkürliche Oberflächentopografien aufweisen, was die Gewebeüberbrückung schwierig macht.

Diese Studie schlägt einen Gewebekleber in Form von klebenden Kryogelpartikeln (ACPs) aus Chitosan, Acrylsäure, 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) vor. Die Haftungsleistung wurde durch den 180-Grad-Schältest an einer Gewebesammlung einschließlich Schweineherz, -darm, -leber, -muskel und -magen untersucht. Die Zytotoxizität von ACPs wurde anhand der Zellproliferation menschlicher normaler Leberzellen (LO2) und menschlicher Darmepithelzellen (Caco-2) bewertet. Der Entzündungsgrad und die biologische Abbaubarkeit wurden in dorsalen subkutanen Rattenmodellen untersucht. Die Fähigkeit von ACPs, unregelmäßige Gewebedefekte zu überbrücken, wurde anhand von Ex-vivo-Modellen aus Schweineherz, -leber und -niere beurteilt. Darüber hinaus wurde ein Modell zur Reparatur von Leberrupturen bei Ratten und einer Darmanastomose bei Kaninchen erstellt, um die Wirksamkeit, Biokompatibilität und Anwendbarkeit in der klinischen Chirurgie zu überprüfen.

ACPs sind auf begrenzte und unregelmäßige Gewebedefekte anwendbar, wie z. B. tiefe Fischgrätenrillen in den Parenchymorganen und ringförmige Abschnitte in den Schwellkörperorganen. ACPs bildeten eine starke Adhäsion zwischen Geweben [(670,9 ± 50,1) J/m2 für das Herz, (607,6 ± 30,0) J/m2 für den Darm, (473,7 ± 37,0) J/m2 für die Leber, (186,1 ± 13,3) J/ m2 für Muskeln und (579,3 ± 32,3) J/m2 für den Magen]. ACPs zeigten in einer In-vitro-Studie eine beträchtliche Zytokompatibilität mit einer hohen Zelllebensfähigkeit für 3 Tage [(98,8 ± 1,2) % für LO2 und (98,3 ± 1,6) % für Caco-2]. Es weist eine vergleichbare Entzündungsreparatur bei einer gerissenen Rattenleber auf (P = 0,58 im Vergleich zum Nahtverschluss), das Gleiche gilt für die Darmanastomose bei Kaninchen (P = 0,40 im Vergleich zum Nahtanastomose). Darüber hinaus war die ACP-basierte Darmanastomose (weniger als 30 s) deutlich schneller als der herkömmliche Nahtprozess (mehr als 10 min). Wenn ACPs nach einer Operation abgebaut werden, heilen die Gewebe über die Adhäsionsschnittstelle hinweg.

ACPs sind ein vielversprechender Klebstoff für klinische Einsätze und die Rettung auf dem Schlachtfeld, da sie in der Lage sind, unregelmäßige Gewebedefekte schnell zu überbrücken.

In der therapeutischen Praxis führen Chirurgen in der Regel konventionelle Nähte durch, um verletztes Gewebe zu rekonstruieren, das automatisch in Fragmente mit begrenzten und unregelmäßigen Defekten zerfällt. Beispielsweise kann ein gewalttätiges Trauma Gliedmaßen und Organe brechen, was zu Wunden mit tiefen, schmalen Rillen führt [1,2,3,4]. Die Blutgefäße und Darmtrakte können während der Operation durchtrennt werden, was zu unregelmäßigen ringförmigen Querschnitten führt [5,6,7,8]. Die Rekonstruktion von Gewebe erfordert eine oberflächliche Blutstillung und die Überbrückung separater Gewebe. Allerdings ist die Überbrückung begrenzter Gewebe mit unregelmäßigen Oberflächen eine Herausforderung. Das Nähen ist die am weitesten verbreitete Methode zur Überbrückung von Gewebe, aber das Verfahren kann bei unregelmäßig geformtem Gewebe äußerst zeitaufwändig sein [9] und weist eine hohe Leckagerate an den Schnittstellen oder durch die Nadellöcher auf [10, 11].

Klebstoffe sind eine vielversprechende Möglichkeit, Gewebe zu überbrücken [12]. Verschiedene Gewebeklebstoffe, darunter Cyanacrylat, Fibrin, Polyethylenglykolklebstoffe, Nanopartikel, bioinspirierte Klebstoffe und Hydrogele, wurden verwendet. Es wurden jedoch mehrere Nachteile hervorgehoben, wie z. B. mangelnde Biokompatibilität (z. B. Cyanacrylat [13, 14, 15]) und schwache Haftung an Geweben (z. B. Fibrin [16, 17, 18], Polyethylenglykol [19, 20], Nanopartikel). [21] und bioinspirierte Klebstoffe [22]). Im Gegensatz dazu weisen adhäsive Hydrogele eine ausgezeichnete Biokompatibilität auf und weisen eine starke Haftung an Gewebe, eine kontrollierte Arzneimittelfreisetzung und Wundmanagementfähigkeiten auf [23,24,25,26]. Vorgefertigte Hydrogele sind jedoch nur begrenzt für begrenzte und unregelmäßige Gewebedefekte anwendbar [27, 28]. Obwohl Hydrogel-Tapes in der Lage sind, mit ultrastarken und fehlertoleranten Adhäsionen an Gewebeoberflächen zu haften [29], kann eine innere Kapillarleckage nicht verhindert werden, da die Tapes außerhalb der Defekte angebracht werden. Im Fall von Hydrogel-Vorläufern, die direkt auf beliebige Gewebedefekte aufgetragen werden, sind die resultierenden Hydrogele immer schwach und der Gelierungsprozess kann externe Reize erfordern (z. B. UV-Bestrahlung [30], Erhitzen [31, 32] und pH-Änderung [27]). ), die an Gewebe-Gewebe-Grenzflächen nicht anwendbar sind. Obwohl Pasten und auf Trockenpartikeln basierende Gewebeklebstoffe Vorteile bei der Anwendung bei begrenzten und unregelmäßigen Gewebedefekten bieten [33,34,35,36,37,38], würden die nicht abbaubaren Wirkstoffe zusammen mit diesen Hydrogelen im Gewebe zurückgehalten und den Materialaustausch behindern und Gewebeheilung durch die Schnittstellen. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass ein Koazervat in der Lage ist, an unregelmäßigen Zielstellen Platz zu finden [39], die Umwandlung in ein Hydrogel dauerte jedoch lange (ungefähr 10 Minuten) und die mangelnde biologische Abbaubarkeit schränkt seine Anwendung zwischen Gewebe-Gewebe-Oberflächen ein. Im Allgemeinen muss ein idealer Gewebeklebstoff drei Anforderungen erfüllen: 1) Die Klebstoffe müssen in der Lage sein, an den Grenzflächen begrenzter und unregelmäßiger Gewebedefekte zu haften [6, 7]; 2) Die Grenzflächenhaftung muss sich schnell bilden und stark genug sein, um den auferlegten mechanischen Belastungen standzuhalten [40]; 3) Die reservierten Klebstoffe sollten biokompatibel und biologisch abbaubar sein, damit sie den Materialaustausch und die Heilung von Geweben nicht behindern [12].

Um die begrenzten und unregelmäßigen Gewebedefekte zu überbrücken, haben wir die klebenden Kryogelpartikel (ACPs) entworfen und synthetisiert, die sich in Vorbereitung und Anwendung von früheren Klebstoffen unterschieden. Zur Vorbereitung wurden ACPs durch Gefriertrocknung und Mahlen eines Hydrogels synthetisiert. Die resultierenden Klebstoffe waren partikelartig und unterschieden sich in ihrer Morphologie von den meisten anderen Klebstoffen wie Klebeband, Leim und Vorläufern. ACPs könnten über eine schnelle, milde und kostengünstige Synthesestrategie erhalten werden, da die Polyacrylsäureketten über das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid ( NHS)-Reaktion, anstatt das teure vorbehandelte biologische Polymer zu verwenden. In der Anwendung unterscheiden sich ACPs von anderen Klebstoffen dadurch, dass sie nicht nur auf Gewebeoberflächen, sondern auch auf Gewebe-Gewebe-Grenzflächen aufgetragen werden können. ACPs dienten als Klammern, die Gewebe Punkt für Punkt überbrücken. Die ACPs in Mikrogröße können leicht auf unregelmäßig geformte Gewebeoberflächen aufgetragen werden und dort Adhäsionen bilden. Die Partikel wurden porös hergestellt, sodass sie Restwasser aus dem Gewebe schnell absorbieren und ohne Stimulation zu klebenden Hydrogelen werden konnten. Die adhäsiven Hydrogele enthalten funktionelle Gruppen, die eine sofortige und starke Haftung an Gewebeoberflächen bewirken. Daher wurden ACPs verwendet, um Gewebe innerhalb von 10 s mit Grenzflächenadhäsionsenergien zu überbrücken, die mit der Bruchenergie des Gewebes vergleichbar waren. Die Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit in Zellkultur und dorsaler subkutaner Implantation wurden ebenfalls validiert. Diese Studie zeigt, dass die Anwendung von ACPs auf verschiedene zerstörte Gewebe in vivo und ex vivo möglich ist. ACPs mit Anpassung an beliebige Gewebeoberflächen zeigen sofort starke Adhäsionen und weisen eine ausgezeichnete Biokompatibilität auf. Sie sind als Klebstoffe zur Überbrückung von Gewebe in zahlreichen klinischen Praxen vielversprechend.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Zhejiang (#ZJU20220181) genehmigt und die postoperative Versorgung wurde vom Personal des Tierversuchszentrums des Sir Run-Run Shaw Hospital der Universität Zhejiang überwacht.

Zur Herstellung des adhäsiven Hydrogels werden Acrylsäure (AAc, Aladdin), Chitosan (MW = 30.000, Macklin), α-Ketoglutarsäure (α-Keto, Sigma-Aldrich), NHS (Macklin) und EDC (Yuanye Bio-Technology) verwendet. wurden benutzt. Zur Reinigung des oben genannten Hydrogels und zur Entfernung des nicht umgesetzten AAc wurde Kochsalzlösung verwendet. Mit flüssigem Stickstoff wurden vorbereitete Hydrogele gefriergetrocknet, wodurch ACPs entstanden. Während des In-vitro-Bioabbautests wurden Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, ohne Kalzium und Magnesium, Gibco), Lysozym (Sigma-Aldrich) und Pankreatin (Solarbio) verwendet. Im 180-Grad-Schältest wurden Acrylamid (AAm, Aladdin), N,N'-Methylenbisacrylamid (MBAA, Sigma-Aldrich) und α-Ketoglutarsäure (α-Keto, Sigma-Aldrich) verwendet, um ein zähes Hydrogel herzustellen . Darüber hinaus bestand die steife Trägerschicht für die Tücher und das robuste Hydrogel aus Poly(methylmethacrylat)-Filmen (70 μm dick, Anyuan Tech) und Sekundenkleber (PR100, 3 M).

Zur Herstellung des Klebstoffs wurden 0,02 g Chitosan, 0,01 g EDC und 0,004 g NHS zu 5 ml entionisiertem Wasser gegeben und dann gerührt. 1 ml AAc wurde tropfenweise in die Mischung gegeben und das Chitosan löste sich vollständig auf. Als die Suspensionsflüssigkeit in eine Lösung umgewandelt wurde, wurden 100 μl α-Ketolösung (0,1 mol/L in entionisiertem Wasser) als Initiator zum Vorläufer gegeben. Nach der Ultraschallentschäumung wurde die vorbereitete Lösung in eine Spritze überführt und unter anaeroben Bedingungen als Form verwendet. Anschließend wurde die Spritze 60 Minuten lang ultravioletter (UV) Strahlung (365 nm, 500 mJ/cm2 Leistung) ausgesetzt. Das Hydrogel wurde aus der Spritze entnommen und 72 Stunden lang in 250 ml Kochsalzlösung getaucht. Die Salzlösungen wurden täglich aufgefrischt, um das restliche Acrylmonomer zu entfernen (Zusatzdatei 1: Abb. S1a, b).

Zur Herstellung von ACPs wurde der gereinigte adhäsive Hydrogelblock in flüssigen Stickstoff getaucht und vollständig gefroren. Das gefrorene Hydrogel wurde dann 30 Sekunden lang gemahlen, um gefrorenes Hydrogelpulver zu erhalten. Das Pulver wurde 72 Stunden lang gefriergetrocknet. ACPs wurden in einem Aluminiumfolienbeutel versiegelt und vor der Verwendung in einer Trockenbox mit Trockenmitteln gelagert (Zusatzdatei 1: Abb. S1c, d).

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Gewebe- und Hydrogelproben vor dem Eintauchen in ACPs mit PBS gewaschen und dann 10 Sekunden lang gepresst (mit einem Gewichtsdruck von 6,25 kPa). Alle Proben für mechanische Tests wurden in Stücke von 2 cm Breite und 8 cm Länge geschnitten. Die Dicke der Proben lag je nach geometrischer Morphologie des Gewebes zwischen 2 und 5 mm. Bei einem standardmäßigen 180-Grad-Schältest (5465, Instron) wurde die Grenzflächenzähigkeit bei einer konstanten Schälgeschwindigkeit von 100 mm/min gemessen. Auf der repräsentativen Kraft-Weg-Kurve nahm die Kraft zu und erreichte ein Plateau, was zeigt, dass die anhaftende Probe in einem stationären Zustand abgezogen wird (Zusatzdatei 1: Abb. S2). Die Plateaukraft wurde aus dem Mittelwert im stetigen Schälvorgang berechnet. Die Grenzflächenzähigkeit entspricht dem Doppelten der Plateaukraft dividiert durch die Breite der Probe. Auf den Proben wurde eine Poly(methylmethacrylat)-Folie befestigt, wobei Sekundenkleber als Trägerschicht verwendet wurde. Der durch den 180-Grad-Schältest erfasste Punkt wurde drei- bis fünfmal wiederholt und als Mittelwert und Standardabweichung angezeigt.

Um die Abbaubarkeit von ACPs zu messen, wurden ACPs getrennt in zwei verschiedene Enzymlösungen eingetaucht. Für den Abbautest in der Pankreatinlösung wurden ACPs (~ 0,1 g) in 10 ml handelsübliche Trypsinlösung getaucht. Für den Abbautest in Lysozymlösung wurden 500 μl einer wässrigen Lysozymlösung mit 1 mg/ml zu 10 ml DPBS gegeben. Anschließend wurde die Pankreatinlösung durch Lysozym ersetzt. Alle Proben wurden in Glasfläschchen (20 ml) versiegelt und bei 37 °C unter Schütteln bei 220 U/min inkubiert. Alle 2 Tage wurden die verbleibenden ACPs aus dem Medium abgerufen. Zunächst wurde die Probe zentrifugiert, um die Abbauprodukte von ACPs und Salzen aus PBS zu entfernen. Anschließend wurden die ACPs dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Abschließend wurde die Probe gefriergetrocknet und gewogen. Zur Bestimmung des Abbaus wurde das Verhältnis der Masse der verbleibenden lyophilisierten ACPs zur Masse der ursprünglichen ACPs herangezogen.

ACPs und andere an ACPs haftende Gewebe wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (GEMINI 300, ZEISS) untersucht. Im Detail wurde die an ACPs haftende Gewebeprobe in kleine quadratische Stücke (Seitenbreite = 5 mm) geschnitten und anschließend in flüssigen Stickstoff getaucht, um die Form zu fixieren. Anschließend wurde die kryogefrorene Probe lyophilisiert und Platinsputtern zur Verbesserung der Bildqualität eingesetzt (Zusatzdatei 1: Abb. S3).

Zur Charakterisierung der Zusammensetzung von ACPs wurde ein Transmissions-FTIR (iS50, Thermo Fisher) mit der KBr-Pellet-Methode verwendet. Jedes Spektrum wurde achtmal mit einem Wellenzahlbereich von 4000–400 cm−1 und einer Auflösung von 4 cm−1 gescannt. Die charakteristischen Absorptionspeaks wurden im FTIR-Spektrum markiert (Zusatzdatei 1: Abb. S4).

Zur Analyse des restlichen Acrylmonomers aus ACPs wurde analytische HPLC mit einer C18-Säule (HPLC; U3000, Thermo Fisher) verwendet. Der Analyt für die HPLC wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurden 10 ml adhäsives Hydrogel in 500 ml Kochsalzlösung 3 Tage lang unter Rühren inkubiert. Nicht umgesetztes AAc diffundierte von den adhäsiven Hydrogelen in die Salzlösung, bis ein Gleichgewicht erreicht war. Um eine Sättigung zu vermeiden, wurden die Salzlösungen täglich aufgefrischt. Anschließend wurde der gesammelte Überstand mit einem sterilen 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert und zur Analyse in das HPLC-System injiziert. Um die Kalibrierungskurve zu erhalten, wurde eine Reihe von Standardlösungen von AAc mit unterschiedlichen Konzentrationen, d. h. 20 ng/ml, 50 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml und 500 ng/ml, verwendet. Beim HPLC-Verfahren besteht die mobile Phase aus zwei Teilen: A) 0,35 %iger wässriger Phosphorsäurelösung (95 % Volumenprozent) und B) Acetonitril (5 % Volumenprozent). (Zusatzdatei 1: Abb. S5) Die Flussrate wurde auf 1 ml/min festgelegt, die Elutionszeit betrug 10 min und die Eluentenerkennung wurde bei 210 nm überwacht. Die Konzentration des restlichen Acrylmonomers in ACPs wurde basierend auf der Kalibrierungskurve unterschiedlicher Acrylsäuremonomerkonzentrationen berechnet.

In-vitro-Biokompatibilitätstests wurden unter Verwendung eines ACPs-konditionierten Mediums für die Zellkultur durchgeführt (Zusatzdatei 1: Abb. S6). Um das ACPs-konditionierte Medium für In-vitro-Biokompatibilitätstests vorzubereiten, wurde 1 mg ACPs in 1 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin und 1 % Streptomycin, bei 37 °C inkubiert 24 Std. Als Kontrolle wurde unberührtes DMEM ohne ACPs verwendet. Entweder LO2- oder Caco-2-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 3.000 Zellen/Well ausplattiert und über Nacht in DMEM gehalten. Die vorbereiteten Zellen wurden dann mit den ACP-konditionierten Medien oder unberührtem DMEM behandelt. Nach Inkubation bei 37 °C für 24 h/48 h/72 h bei 5 % CO2 wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem LIVE/DEAD® Viability Assay Kit für Säugetierzellen (Thermo Fisher Scientific) bewertet, das eine zweifarbige Fluoreszenzzelllebensfähigkeit liefert Assay, der auf der gleichzeitigen Bestimmung lebender und toter Zellen mit zwei Sonden basiert, die anerkannte Parameter der Zelllebensfähigkeit messen. Das Protokoll wurde unten demonstriert: 1) Fläschchen auftauen; 2) Übertragen Sie Live Green (Comp. A) in Dead Red (Comp. B); 3) Mischen, um eine 2X-Arbeitslösung zu erhalten; 4) Geben Sie innerhalb von 2 Stunden ein gleiches Volumen der 2X-Arbeitslösung zu den Zellen. 5) 15 Minuten lang bei 20 ℃–25 ℃ inkubieren; 6) Bildzellen. Und ein konfokales Mikroskop (LSM900, ZEISS) wurde verwendet, um lebende Zellen (grün) und tote Zellen (rot) bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 495 nm/515 nm bzw. 495 nm/635 nm abzubilden. Das Cell Counting Kit-8 (Yeason, China) wurde verwendet, um die Zellproliferation gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Zur Messung der Absorption bei 450 nm wurde ein Multiscan-Spektrophotometer (Thermo Scientific) verwendet.

Für Biokompatibilitäts- und biologische Abbaubarkeitstests wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225 g bis 250 g) verwendet. Alle Ratten (n = 30) wurden zufällig der ACP-Gruppe (n = 15) und der Fibrin-Gel-Gruppe (Hanbang, China) (n = 15) zugeordnet, um die Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit von ACPs zu bewerten. Untergruppen als: ACPs D3 (n = 5), ACPs W1 (n = 5), ACPs W2 (n = 5), Fibringel D3 (n = 5), Fibringel W1 (n = 5) und Fibringel W2 ( n = 5). Vor der Implantation wurden ACPs und das Fibringel in einer sterilen Umgebung vorbereitet. Zur Implantation von ACPs oder des Fibrin-Gels in den dorsalen subkutanen Raum wurden Ratten durch intraperitoneale Verabreichung von Ketamin (80 mg/kg) anästhesiert. Die Rückenhaare der Ratten wurden entfernt und sie wurden während der Operation auf ein Heizkissen gelegt. Nachdem ein 1 cm langer Hautschnitt in der Mitte des Rückens der Ratte vorgenommen wurde, wurde eine 1/2 cm lange stumpfe Dissektion vom Einschnitt in Richtung des Kopfes der Ratte durchgeführt, um Platz für die Implantation zu schaffen. Entweder 1 mg ACPs oder 0,1 ml Fibringel wurden subkutan implantiert. Pro Ratte wurden bis zu drei Implantate eingesetzt, wobei sichergestellt wurde, dass die einzelnen Räume nicht überlappten. Der Rückenschnitt wurde durch Einzelknopfnähte (4–0 Prolene, Ethicon) verschlossen. Alle Experimente wurden in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Am Tag 3, Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation wurden die Ratten durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Subkutane Regionen von Interesse wurden präpariert und für histologische Analysen 24 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert. Zwei Wochen nach der Implantation wurde Blut zur Analyse entnommen (Zusatzdatei 1: Abb. S7).

Zur Reparatur von Leberrupturen bei Ratten wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225 g bis 250 g) (n = 30) zufällig der ACP-Gruppe (n = 15) und der Nahtgruppe (n = 15) zugeordnet. Untergruppen als: ACPs D3 (n = 5), ACPs W1 (n = 5), ACPs W2 (n = 5), Naht D3 (n = 5), Naht W1 (n = 5) und Naht W2 (n = 5). ). Die Ratten wurden durch intraperitoneale Verabreichung von Ketamin (80 mg/kg) anästhesiert. Die Bauchhaare wurden entfernt und die Ratten wurden während der Operation auf ein Heizkissen gelegt. Die Leber wurde über einen Bauchschnitt in der Mittellinie freigelegt. Chirurgen führten mit einer Biopsiestanze (Miltex) einen Einschnitt von 4 mm Durchmesser und 7 mm Tiefe in die Leber durch. ACPs (2 mg) wurden in das punktierte Loch aufgetragen und dann 10 Sekunden lang sanft gedrückt, um den Bruch zu reparieren. Für die Nahtgruppe wurden zusätzlich Einzelknopfnähte (5–0 Prolene, Ethicon) hinzugefügt, um den Bruch zu reparieren. Abschließend wurde das Peritoneum mit fortlaufenden Nähten (4–0 Prolene, Ethicon) und der Bauch mit Einzelknopfnähten (4–0 Prolene, Ethicon) verschlossen. Alle Experimente wurden in einer sterilen Umgebung durchgeführt. In der zweiten Woche nach der Operation wurden die Ratten durch CO2-Inhalation eingeschläfert und das Blut zur Analyse gesammelt (Zusatzdatei 1: Abb. S8). Von der Leberruptur-Reparatur interessante Regionen wurden präpariert und zur histologischen Analyse 24 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert.

Zur Rekonstruktion des Verdauungstrakts wie der Darmanastomose wurden weibliche Neuseeland-Kaninchen (2000 g bis 2500 g) (n = 30) zufällig der ACP-Gruppe (n = 15) und der Nahtgruppe (n = 15) zugeordnet. Untergruppen als: ACPs D3 (n = 5), ACPs W1 (n = 5), ACPs W2 (n = 5), Naht D3 (n = 5), Naht W1 (n = 5) und Naht W2 (n = 5). ). Nach 24-stündigem Fasten wurden die Kaninchen durch intraperitoneale Verabreichung von Ketamin (80 mg/kg) anästhesiert. Wir entfernten die Bauchhaare der Kaninchen und legten sie während der Operation auf ein Heizkissen. Der Dünndarm wurde über den Bauchschnitt in der Mittellinie freigelegt. Nachdem die Randgefäße abgebunden waren, führten wir eine seitliche Darmanastomose mit ACPs durch. Der nicht-chirurgische Bereich wurde mit Gaze abgedeckt, um einen unerwarteten Kontakt mit ACPs zu vermeiden. ACPs wurden vorsichtig mit einem kleinen Edelstahlpflücker auf der Seite des Darms verteilt. Der Darm mit ACPs wurde an einen anderen Darmabschnitt gleicher Länge befestigt und 10 s lang gehalten.

Durch einen Minischnitt am Ende der Anastomose haben wir den Bindedarm 1 cm der Länge nach durchtrennt und den Darminhalt sauber entnommen. Nach der Entfernung des Darminhalts, der Reinigung des Lumens und der Desinfektion des Mini-Einschnitts wurde der Mini-Einschnitt durch Umkehren von Einzelknopfnähten (6–0 Prolene, Ethicon) verschlossen, um eine Darmanastomose von Seite zu Seite zu erreichen. Es wurde eine positive Kontrollgruppe mit konventioneller seitlicher Darmanastomose durch Einschneiden der Darmseiten von 1 cm in Längsrichtung und Umkehren von Einzelknopfnähten (6–0 Prolene, Ethicon) festgelegt. Alle Experimente wurden in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Nach 24 Stunden erhielten die Kaninchen eine flüssige Nahrung und nach 48 Stunden eine normale Nahrung. In der zweiten Woche nach der Operation wurde Blut zur Analyse entnommen (Zusatzdatei 1: Abb. S9) und anschließend wurden die Kaninchen durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Für histologische Analysen wurden die interessierenden Bereiche der Anastomosestellen präpariert und 24 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert.

Die blinde histologische Beurteilung wurde von einem Pathologen in der Abteilung für Pathologie des Sir Run-Run Shaw Hospital der Zhejiang-Universität durchgeführt. Die repräsentativen Bilder wurden in der Studie bereitgestellt. Die Histopathologie von Leberschnitten und Darmschnitten wurde mit der Bewertung der Entzündung (Lymphozyten- und Neutrophileninfiltration) untersucht [41]. Der Entzündungsgrad wurde unten dargestellt: 1) Grad 0, keine Entzündungszellen; 2) Grad 1, < 10 Infiltration von Entzündungszellen pro Hochleistungsfeld (HPF); 3) Grad 2, > 10 Infiltration von Entzündungszellen pro HPF mit ≤ 50 % der Submukosa um die Wunde; 4) Grad 3, Infiltration von Entzündungszellen mit > 50 % der Submukosa um die Wunde (Zusatzdatei 1: Abb. S10).

GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) wurde verwendet, um die statistische Signifikanz aller Vergleichsstudien in diesem Artikel durchzuführen. In der statistischen Analyse zum Vergleich zwischen mehreren Stichproben wurde der Student-t-Test verwendet, während zum Vergleich zwischen mehreren Datengruppen eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt wurde. Bei der statistischen Analyse zwischen zwei Datengruppen werden die statistische Signifikanz und die P-Werte durch den Student-t-Test bestimmt. Ein AP-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

ACPs dienen dazu, Gewebe in vier Stufen wie folgt zu überbrücken (Abb. 1). 1) Anwendung: ACPs werden auf Mikrometergröße gemahlen, sodass sie auf mikrometergroße Gewebedefekte aufgetragen werden können und in diese passen, um sich an begrenzte und unregelmäßige Oberflächentopografien anzupassen. ACPs sind klein, können aber nicht weggeblasen werden und können durch Bestäuben, Eintauchen usw. auf Gewebeoberflächen aufgetragen werden (Abb. 1a). 2) Aggregation: Die Gewebeoberflächen sind oft feucht und blutig. ACPs sind so konzipiert, dass sie porös sind, um verbleibende Gewebefeuchtigkeit schnell aufzunehmen. Nach der Absorption quellen die ACPs zu Hydrogelpartikeln mit klebrigen Eigenschaften auf. Die Hydrogele bestehen aus mit Chitosan vernetzten Polyacrylsäure-Polymernetzwerken, die die Wasserstoffbindung zwischen den Partikeln erleichtern (Abb. 1b). Dadurch schwellen die ACPs an und aggregieren zu adhäsiven Hydrogel-Clustern. 3) Brückenbildung: Das Polymernetzwerk von Polyacrylsäure weist zahlreiche Carbonsäuregruppen auf. Sie können schnell Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen mit Gewebeoberflächen bilden. Durch die sichere Haftung an beiden Seiten der Schnittstelle von Gewebedefekten verbinden Hydrogel-Cluster diese Gewebe. 4) Abbau: Chitosan, das Vernetzungsmittel für Hydrogel-Polymernetzwerke, wird abgebaut, wenn die Glykosidbindungen an seinem Rückgrat durch Enzyme gespalten werden. Wenn Chitosan abgebaut wird, nimmt die Vernetzungsdichte des Polymernetzwerks ab und das Hydrogel verwandelt sich von einem unlöslichen Feststoff in eine Polymerlösung. Mit der Gewebeerneuerung kommt es zum Abbau. Das rekonstruierte Gewebe heilt allmählich und ACPs werden eliminiert. Die chemischen und physikalischen Veränderungen von ACPs, die im Laufe der Zeit zwischen Geweben angewendet werden, können in die oben genannten sechs Zustände unterteilt werden, nämlich Anwendung, Schwellung, Aggregation, Überbrückung, Abbau und Gewebeheilung (Abb. 1c). Darüber hinaus haben wir vier typische Stadien ausgewählt (Partikelaufbringung, Schwellung und Aggregation, Überbrückung zur Rekonstruktion und Abbau nach der Heilung), um die Veränderungen der inneren ACPs zu veranschaulichen (Abb. 1d).

Schematische Darstellung des Mechanismus von ACPs in Brückengeweben. a ACPs werden zur Überbrückung an den Grenzflächen zwischen Geweben eingesetzt. Tiefe Fischgrätenrillen sind repräsentative begrenzte und unregelmäßige Topographien für stark verletztes Gewebe und lassen sich mit Klebstoffen nur schwer überbrücken. b ACPs enthalten Polymernetzwerke aus Chitosan, vernetzt mit Polyacrylsäure. Sie bilden Hydrogel-Cluster an Gewebegrenzflächen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen Punkt für Punkt einzelne Gewebe miteinander verbinden. c Die morphologischen Veränderungen von ACPs und die Entwicklung der Gewebeheilung durch die Anwendung von ACPs. Nach dem Auftragen an Gewebeschnittstellen quellen ACPs durch die Absorption von Restwasser auf, aggregieren zu adhäsiven Hydrogel-Clustern, überbrücken Gewebe mit Bindungen und werden bei der Gewebeheilung abgebaut. d Die Entwicklung der Polymerkette und die Bindungsbildung von ACPs beim Auftragen, Quellen/Aggregation, der Gewebeüberbrückung und beim Abbau. e Rasterelektronenmikroskopische Bilder von ACPs im Pose-Vorbereitungszustand, im Quellzustand, im aggregierten Zustand und im Brückenzustand. Der Brückenzustand wird erfasst, nachdem ACPs zur Überbrückung zweier Teile des Schweinedarms verwendet wurden. ACPs haftende Kryogelpartikel

Um dieses Design zu schaffen, wurden mikrogroße, poröse, klebende, biokompatible und biologisch abbaubare ACPs hergestellt. Es wurden Hydrogele aus mit Chitosan vernetzten Polyacrylsäurenetzwerken synthetisiert (Zusatzdatei 1: Abb. S11). Chitosan verfügt über zahlreiche Amidgruppen und bildet durch Kondensation mit Carbonsäuregruppen auf Acrylsäure eine Peptidbindung. Zur Beschleunigung der Kondensation wurde EDC zusammen mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) zugesetzt. Eine Chitosankette fungiert als biologisch abbaubarer Vernetzer des Polymernetzwerks, nachdem sie mit mehr als einem Acrylsäuremonomer kondensiert wurde. Die Kondensation wurde durch das Vorhandensein von CN-C-Einheiten validiert, die mithilfe des Transmissions-FTIR-Spektrums nachgewiesen werden konnten (Zusatzdatei 1: Abb. S4). Das Hydrogel wurde durch radikalische Polymerisation von Acrylsäure unter UV-Licht gehärtet. Das Hydrogel wurde dann mit Kochsalzlösung gereinigt, um das giftige restliche Acrylsäuremonomer aus der biokompatiblen Polyacrylsäure zu entfernen (Zusatzdatei 1: Abb. S5). Das resultierende Hydrogel war klebend, weich (Elastizitätsmodul von 0,46 kPa) und hochflexibel (kann sich auf 59,3 Falten dehnen) (Zusatzdatei 1: Abb. S12). Das adhäsive Hydrogel wurde zu Kryogel gefriergetrocknet und zu Partikeln gemahlen (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Die resultierenden ACPs hatten Durchmesser von ~ 10 μm und waren porös (Porengröße ~ 1 μm). Während des Adhäsionsprozesses unterliegt die Morphologie der ACPs einer Reihe von Transformationen im Quell-, Aggregations- und Brückenbildungsprozess. Nach der Anwendung nehmen die porösen ACPs Feuchtigkeit auf und quellen auf. Die ACPs verwandeln sich schnell in nichtporöse Hydrogelpartikel. Dann aggregieren diese Hydrogelpartikel miteinander und verwandeln sich in ein großes Hydrogel mit Kanälen. Das Bulk-Hydrogel haftet an den Gewebeoberflächen und bildet Brücken an den Gewebe-Gewebe-Grenzflächen (Abb. 1e). Die mechanischen Eigenschaften des Bulk-Hydrogels standen im Zusammenhang mit dem Wassergehalt (Zusatzdatei 1: Abb. S13).

Die Adhäsionstechniken von ACPs lassen sich als Punkt-für-Punkt-Klebung zusammenfassen, wobei viele Punkte Oberflächen mit willkürlichen Topographien bilden. Diese Adhäsionsstrategie wurde in der Natur weithin entdeckt (z. B. kleben Seesterne mit ihren zahlreichen Röhrenfüßen an rauen Riffen und Weberameisen weben Blätter, um aus Seide Nester zu bilden) und haben die Integration weicher Materialien durch robuste Brückeninseln, sogenannte molekulare Klammern, inspiriert. Bei dieser Strategie ist die Haftung stabil, sobald die Durchmesser der Brückenpunkte kleiner sind als die Fehlerempfindlichkeitslänge des Klebstoffs.

Zur Bewertung der Haftungsleistung von ACPs wurde ein 180-Grad-Schältest verwendet. Bei diesem Test wurden ACPs zur Haftung zwischen zwei Stücke desselben Materials aufgetragen. Die Adhäsionsenergie Γ wurde berechnet, indem die zweifache gemessene Schälkraft F durch die Breite der Probe W dividiert wurde (Abb. 2a). Zunächst wurde die ACP-Dosierung beurteilt. Als Modellmaterial für die Messung wird ein Polyacrylamid (PAAm)-Hydrogel ausgewählt, da es gut zugänglich ist und stabile physikalische Eigenschaften aufweist, die weichen Geweben ähneln. Abbildung 2b zeigt, dass die Adhäsionsenergie bei niedriger ACP-Dosierung (weniger als 8,6 mg/cm2) drastisch ansteigt, was darauf hindeutet, dass die Menge an ACP nicht ausreichte, um die Oberfläche zu bedecken. Wenn die ACP-Dosis 8,6 mg/cm2 überstieg, änderte sich die Adhäsionsenergie kaum und lag konstant bei etwa 612,9 J/m2. Die Auswirkung des Abbaus auf die Haftungsleistung wurde bewertet. PAAm-Hydrogele wurden mit entionisiertem Wasser hergestellt, das den Abbau nicht fördern kann. Dadurch blieben die ACPs an den PAAm-Grenzflächen stabil und die Adhäsionsenergie blieb nach 3000-minütiger Anwendung der ACPs erhalten. Im Gegensatz dazu kann das Sekret aus dem Magen und Darm von Schweinen verschiedene Enzyme zum Abbau von ACPs enthalten. Die Adhäsionsenergie dieser Gewebe durch ACPs sinkt nach 1500 Minuten auf Null (Abb. 2c). Wir haben auch den Gewichtsverlust von ACPs festgestellt, nachdem sie in Gegenwart von Lysozym- oder Trypsinenzymen abgebaut und aufgelöst wurden (Abb. 2d). Die Enzyme im Magen und Darm sind in der Lage, ACPs schnell abzubauen. Während die ex vivo gemessene Adhäsionsenergie nur die Adhäsion durch ACPs berücksichtigt, heilen die Gewebe in vivo schnell. Die Abbaurate sollte der Heilungsrate des Gewebes entsprechen, damit ACPs die Gewebeheilung nicht verlangsamen.

Grenzflächenadhäsionsleistung der ACPs. ein 180-Grad-Peeling-Aufbau für den Test der Grenzflächenadhäsionsenergie. b Adhäsionsenergie für Hydrogele, die durch unterschiedliche ACP-Dosen verbrückt sind. Die Richtlinien wurden durch lineare Anpassung dargestellt. c Adhäsionsenergien als Funktionen der Zeit für Hydrogele (ACPs werden nicht abgebaut) und Magenstücke (ACPs werden abgebaut), die von den ACPs überbrückt werden. d In-vitro-Bioabbau von ACPs in PBS, PBS mit Lysozym und Pankreatinlösung. e Adhäsionsenergie verschiedener Gewebe, die durch ACPs überbrückt werden. P-Werte werden durch den Student-t-Test bestimmt. f Während der 180-Grad-Peeling-Tests verlängern und überbrücken ACPs das Gewebe, bevor sich Risse an der Grenzfläche bilden. g Nach dem Ablösen bleiben ACPs auf beiden Seiten des Gewebes zurück, was darauf hindeutet, dass ein Kohäsionsfehler durch die ACP-Schichten gegangen ist. Die Werte in ce stellen den Mittelwert ± SD dar (Fehlerbalken zeigen SD an; n = 3–5 unabhängige Proben). ACPs haftende Kryogelpartikel, PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung

ACPs können verschiedene Gewebe überbrücken, darunter Herz, Darm, Leber, Muskel und Magen von Schweinen. Die Zähigkeit des Gewebes und seine Fähigkeit, Bindungen mit ACPs einzugehen, verändern die Adhäsionsleistung. Auf jedes Gewebe wurde drei- bis fünfmal ein 180-Grad-Schältest mit unabhängigen Proben angewendet, um den Mittelwert und die Standardabweichung zu ermitteln. Folglich variiert die Grenzflächenadhäsionsenergie für verschiedene Gewebe [(670,9 ± 50,1) J/m2 für das Herz, (607,6 ± 30,0) J/m2 für den Darm, (473,7 ± 37,0) J/m2 für die Leber, (186,1 ± 13,3) J/m2 für den Muskel und (579,3 ± 32,3) J/m2 für den Magen] (Abb. 2e). ACPs schwellen an und aggregieren an den Gewebegrenzflächen zu adhäsiven Hydrogel-Clustern. Wenn die Grenzflächen durch Abziehen geöffnet werden, werden die Hydrogel-Cluster stark gedehnt, bevor sie reißen. Dies gilt insbesondere für Herzen, die die höchste Adhäsionsenergie aufweisen, da die Hydrogel-Cluster beim Schälen enorm gedehnt werden (Abb. 2f). Der Zusammenhang zwischen der Dehnung des Hydrogel-Clusters und der Adhäsionsenergie wird auf den Verstärkungsmechanismus der Rissüberbrückung zurückgeführt, und die Verformung des Hydrogel-Clusters führt zur Zerstreuung der Energie an der Rissspitze. Die Wechselwirkungen zwischen ACPs und Gewebe waren robust. Kohäsionsversagen zeigt, dass die Grenzflächenadhäsionsfestigkeit größer ist als die aggregierte Hydrogelfestigkeit (Abb. 2g).

Wir untersuchten die Biokompatibilität von ACPs durch Zellkultur in vitro und dorsale subkutane Implantation in vivo. Die Zellproliferation von LO2 und Caco-2 wurde gemessen (Abb. 3a-c). Das konditionierte ACP-Medium hatte im Vergleich zum Kontrollmedium (unberührtes DMEM) keinen Einfluss auf die Zellproliferation. Die Zelllebensfähigkeit blieb nach 72-stündiger Kultivierung in ACPs-konditioniertem Medium auf einem hohen Niveau von (98,8 ± 1,2) % für LO2 und (98,3 ± 1,6) % für Caco-2, was mit der Kontrolle vergleichbar war. Die Lebensfähigkeit der Zellen von LO2 und Caco-2 war auch vergleichbar, nachdem die Zellen 24 oder 48 Stunden lang ACPs ausgesetzt waren oder nicht (Zusatzdatei 1: Abb. S6). Insbesondere wollten wir die Zelllebensfähigkeit und Zellproliferation von LO2 und Caco-2 unter ACPs oder Kontrolle untersuchen, anstatt die Menge von LO2 und Caco-2 unter ACPs zu vergleichen. Zwei Wochen nach der Implantation wurde Blut zur Analyse entnommen. Die Blutanalysen von Entzündungszellen, einschließlich weißer Blutkörperchen (WBC), Neutrophilen (NEU), Monozyten (MON) und Lymphozyten (LYMPH), waren in der gesunden Gruppe, der Fibringruppe und der ACP-Gruppe vergleichbar, was auf die gute Biokompatibilität von ACPs hinweist ( Abb. 4a).

Biokompatibilität von ACPs in vitro. a Fluoreszenzabsorption von LO2 und Caco-2, wenn sie in einem Kontrollmedium und einem ACPs-konditionierten Medium kultiviert werden. b Konfokalmikroskopische Bilder des Lebend-/Tot-Assays von LO2 (oben) und Caco-2 (unten) in Kontroll- und ACPs-konditioniertem Medium für 3 Tage. c In-vitro-Zelllebensfähigkeit von LO2 (oben) und Caco-2 (unten) in einem Lebend-/Tot-Assay nach 3-tägiger Kultur. ACPs-adhäsive Kryogelpartikel, menschliche normale Leberzellen LO2, menschliche Darmepithelzellen Caco-2

Biokompatibilität von ACPs in vivo. a Repräsentative Blutanalysedaten von Ratten nach 2-wöchiger ACP-Implantation. Seien Sie repräsentative histologische Bilder von ACPs, nachdem sie 3 Tage lang (b), 1 Woche (c) und 2 Wochen (d) in den dorsalen subkutanen Raum gepflanzt wurden. e Repräsentative histologische Bilder der Position der Fibrin-Gele, nachdem sie zwei Wochen lang im dorsalen subkutanen Raum implantiert wurden (Fibrin-Gele würden während des H&E-Färbungsprozesses abfallen). Für jedes Bild wurden in 4 weiteren unabhängigen Experimenten ähnliche Ergebnisse erzielt. ACPs haftende Kryogelpartikel, GT-Granulationsgewebe (zeigen die Entzündungsbereiche an), SM-Skelettmuskel

Wir untersuchten auch den Grad der Entzündung und die morphologischen Veränderungen von ACPs, nachdem sie zwei Wochen lang in dorsalen subkutanen Rattenmodellen implantiert worden waren. Wir beobachteten die morphologischen Veränderungen von ACPs im Laufe der Zeit in den histologischen Bildern und zeigten den Abbau von ACPs in vivo (Abb. 4b-d). Die histologische Untersuchung ergab, dass die durch ACPs ausgelöste Entzündungsreaktion mild war und mit der durch Fibrin, einem kommerziellen Produkt von Gewebekleber, verursachten vergleichbar war (Abb. 4d, e). Wir beobachteten auch die morphologischen Veränderungen von ACPs im Laufe der Zeit in den histologischen Bildern und zeigten den Abbau von ACPs in vivo (Abb. 4b-d). Wir haben das Blut von gesunden Ratten sowie von Ratten gesammelt, denen 2 Wochen lang Fibrin oder ACPs implantiert wurden. Die Blutanalysen von Ratten waren in den drei Gruppen ohne deutliche Anzeichen einer Entzündung und systemischen Toxizität vergleichbar (Zusatzdatei 1: Abb. S10).

ACPs sind an jede Oberflächentopographie anpassbar. Wir haben die mögliche Anwendbarkeit der Überbrückung begrenzter Defekte in Organen mit Parenchym und einem diskontinuierlichen Abschnitt in kavernösen Organen mit hohlem Inneren veranschaulicht. Parenchymorgane werden typischerweise durch schwere Wunden geschädigt, die immer eine unregelmäßige Oberflächentopographie aufweisen. Um dies zu demonstrieren, wurde eine Sammlung von Schweineherzen, Lebern und Nieren als Ex-vivo-Modelle und eine Rattenleber als In-vivo-Modell verwendet (Abb. 5a, b, Zusatzdatei 1: Abb. S14a, b). Für die Ex-vivo-Modelle wurden die Gewebe mit einem Skalpell geschnitten, um Wunden in Form tiefer Fischgrätenrillen (über 10 mm tief) zu erzeugen. Zur anschließenden Rekonstruktion wurde die Leber in drei Teile geteilt. Nach dem Entfernen des restlichen Blutes wurden ACPs in die tiefe Wunde gestäubt. Die Rekonstruktionen der abgetrennten Gewebe wurden nach 10-sekündigem Halten der Wunden abgeschlossen. Die abgetrennte Leber wurde ebenfalls rekonstruiert, indem die Schnittstellen in ACPs getaucht und die Teile zusammengesetzt wurden. Die rekonstruierten Gewebeschnittstellen widersetzten sich aufgrund der Überbrückung durch ACPs einem Ablösen (Zusatzdatei 2). Da eine Leberruptur das häufigste Parenchym-Organ-Trauma ist, ist eine Leberreparatur im Notfall erforderlich. Die Anwendung von ACPs bei Gewebeverlustdefekten wurde im Rattenmodell in vivo verifiziert. Zylindrische Löcher (4 mm Durchmesser und 7 mm Tiefe) wurden als Wunden in die Leber des Rattenmodells gegraben. Die Wundgröße ist angesichts des Durchmessers der Rattenleber (zwischen 20 und 30 mm) enorm. Nach Verschluss des Blutflusses mit einer hämostatischen Pinzette und Abwischen von Restblut wurde die tiefe Wunde mit ACPs verschlossen. An der Stelle der reparierten Wunde wurde kein Auslaufen beobachtet, nachdem die Leber durch Öffnen der Pinzette wieder mit Blut versorgt wurde (Zusatzdatei 3). Es wurden fünf unabhängige In-vivo-Experimente durchgeführt, und das Rattenmodell zeigte nach den Operationen mehr als zwei Wochen lang normales Verhalten. Histologische Bilder, die zwei Wochen nach der Operation aufgenommen wurden, zeigten, dass Leberzellen mit vergleichbarer Entzündung über die Grenzfläche wuchsen (Zusatzdatei 1: Abb. S10a, während ACPs teilweise abgebaut wurden (Abb. 5c). Die Blutanalysen von Lebermodellen waren in den drei Gruppen vergleichbar ohne deutliche Entzündungszeichen und systemische Toxizität (Zusatzdatei 1: Abb. S8).

Anwendungen von ACPs in vivo und ex vivo. a Eine Schweineleber wurde ex vivo in drei Stücke geschnitten und weist eine schwere Wunde in Form tiefer Fischgrätenrillen auf. Nachdem die Gewebeschnittstellen mithilfe von ACPs überbrückt wurden, wurde die Leber rekonstruiert. b In vivo wurde einer Rattenleber eine schwere zylindrische Wunde zugefügt. Nach Überbrückung der inneren Schadensoberfläche mit ACPs konnte die Wunde ohne Blutung verschlossen werden. c Repräsentative histologische Bilder der Rattenleber, nachdem sie beschädigt und dann durch ACPs (links) überbrückt oder durch Nähen (rechts) für zwei Wochen repariert wurde. d Seitliche Anastomose eines Schweinedickdarms unter Verwendung von ACPs ex vivo. e Seitliche Anastomose eines Kaninchendünndarms unter Verwendung von ACPs in vivo. f Repräsentative histologische Bilder des Dünndarms von Kaninchen, nachdem sie zwei Wochen lang eine seitliche Anastomose mit ACPs (links) oder Nähten (rechts) durchlaufen hatten. ACPs haftende Kryogelpartikel

Kavernöse Organe werden typischerweise durch diskontinuierliche Querschnitte geschädigt. Dies wurde in den Ex-vivo-Modellen des Schweinemagens (Zusatzdatei 1: Abb. S14c, Zusatzdatei 4) und des Dickdarms (Abb. 5d, Zusatzdatei 5) sowie im In-vivo-Modell des kleinen Kaninchens gezeigt Darm (Abb. 5e, Zusatzdatei 1: Abb. S14d, Zusatzdatei 6, Zusatzdatei 7). In den Ex-vivo-Modellen wurde der Magen mit einem Fischgrätenschnitt durchstochen und der Dickdarm in ringförmige Abschnitte geschnitten. Nach dem Auftragen von ACPs auf die äußere Oberfläche des Magens und um den Einschnitt herum wurden die Oberflächen mit ACPs gefaltet und zusammengedrückt. Anschließend wurde der Einschnitt ohne Leckage verschlossen, auch wenn der Magen mit Wasser gefüllt war. ACPs wurden auf die äußere Oberfläche des Dickdarms aufgetragen, indem der Darm nach innen gedreht und eingetaucht wurde. Der wieder verbundene Dickdarm mit einem Durchmesser von 30 mm widerstand vor dem Bruch einer Abzugskraft von 4,7 N (Zusatzdatei 1: Abb. S15). Im Vergleich zum Berstdruck von 3,7 kPa aus dem fest genähten Darm, aus dem Luft durch das Loch austrat, überbrückten ACPs den Darm mit einem Widerstandsdruck von 7,8 kPa, bevor die Adhäsion an der Grenzfläche versagte (Zusatzdatei 1: Abb. S16, Zusatzdatei 8 ). Da der Darmdurchbruch das häufigste kavernöse Organtrauma darstellt, ist eine Darmanastomose zur Rekonstruktion des Verdauungstrakts erforderlich. Im In-vivo-Kaninchenmodell wurde eine Darmanastomose mit ACPs durchgeführt (Abb. 5e). Während der Operation verwendeten wir sterile Gaze, um den Operationsbereich abzutrennen (Zusatzdatei 1: Abb. S17a), um das Risiko von Verwachsungen im Bauchbereich zu vermeiden. In der Zwischenzeit haben wir auch die Durchgängigkeit des Darms nach der Darmanastomose unter Berücksichtigung des Restpulvers intraluminal überprüft (Zusatzdatei 1: Abb. S17b). In der zweiten Woche nach der Operation beobachteten wir in der ACP-Gruppe keine Bauchverklebungen oder Darmobstruktionen (Zusatzdatei 1: Abb. S17c). Die Modellkaninchen zeigten 2 Wochen nach der Operation ein normales Verhalten. Die Darmschleimhaut wurde innerhalb von 2 Wochen bei vergleichbarer Entzündung rekonstruiert und überbrückt (Abb. 5f und Zusatzdatei 1: Abb. S10b). Bei der Operation dauert die Überbrückung des Darms durch ACPs weniger als 30 s, was deutlich schneller ist als das Nähen, das mehr als 10 min dauert.

Es wurden verschiedene Gewebeklebstoffe entwickelt, die von zytotoxisch bis biokompatibel und von schwach bis stark haftend reichen. Die meisten Klebstoffe eignen sich nur zur Wundversiegelung und zur Blutstillung, was für die Behandlung schwerer Verletzungen wie Organrupturen und Risse im Verdauungssystem nicht ausreicht. Diese Verletzungen erfordern die Überbrückung unterschiedlicher Gewebe mit starken Gewebe-Gewebe-Adhäsionen, was zusätzliche Schwierigkeiten mit sich bringt und die meisten Klebstoffe unbrauchbar macht. Insbesondere kommt es zu Verklebungen zwischen Geweben, weshalb die Klebstoffe biologisch abbaubar sein müssen; andernfalls werden sie in das heilende Gewebe eingebettet. Darüber hinaus müssen sie diskontinuierlich sein, um den Massentransfer und das Gewebewachstum über die Grenzfläche hinweg aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus weisen getrennte Gewebe typischerweise unregelmäßige Oberflächentopografien auf, und die Fähigkeit von Klebstoffen, sich an begrenzte und unregelmäßige Grenzflächen anzupassen, ist von Bedeutung. Ziel dieser Forschung war die Entwicklung von Gewebeklebstoffen in Form von ACPs. ACPs können aus einer schnellen, milden und wirtschaftlichen Zubereitung gewonnen werden. Es ist auch in der Lage, begrenzte und unregelmäßige Gewebedefekte für die Anwendung zu erreichen. Sie erfüllen nicht nur die Biokompatibilitäts- und Haftungsanforderungen von Gewebeklebstoffen, sondern erfüllen auch das Kriterium der Überbrückung unterschiedlicher Gewebe. ACPs sind biologisch abbaubar und ermöglichen diskontinuierliche Gewebeschnittstellen. Darüber hinaus ist die Anwendung von ACPs unkompliziert, was für eine Vielzahl chirurgischer Eingriffe von Vorteil ist, da es die für den Gewebeaufbau erforderliche Zeit verkürzt. In aktuellen Berichten haben wir die Leistung von ACPs mit Gewebeklebstoffen verglichen, darunter Hydrogelband [24, 29], Paste [37], Fibringel, UV-härtbarer chirurgischer Kleber [42] und Cyanacrylatkleber, GI-Pflaster [43], Koazervat- abgeleitetes Hydrogel [39], Klebepulver [36] (Tabelle 1). ACPs zeichnen sich durch eine hohe Adhäsionsenergie, schnelle Adhäsionsbildung, ausgezeichnete Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und morphologische Anpassungsfähigkeit aus. Obwohl es sorgfältig verteilt werden muss, um einen unerwarteten Kontakt von ACPs mit irrelevantem Gewebe während der Anwendung von ACPs zu vermeiden, weist es in der klinischen Praxis immer noch eine ausreichende Manövrierfähigkeit auf.

In dieser Studie wurden die Adhäsion und biologische Leistung von ACPs charakterisiert. Die Adhäsionsenergien an verschiedenen Geweben sind beträchtlich. Es besteht ein bemerkenswerter Unterschied in der Adhäsionsenergie zwischen verschiedenen Gewebesubstraten. Diese gewebeabhängige Adhäsion findet sich auch in neueren Berichten über starke Gewebeadhäsion auf Basis zäher Hydrogele. Beispielsweise zeigte ein zähes Alginat-Polyacrylamid-Hydrogel in verschiedenen Geweben unterschiedliche Adhäsionsenergien (ca. 900 J/m2 für Haut, ca. 900 J/m2 für Knorpel, ca. 600 J/m2 für Herz, ca. 600 J/m2 für Arterien und ca 200 J/m2 für die Leber) [44]. Auch trockenes Hydrogel-Tape zeigte diesen Trend (mehr als 710 J/m2 für die Haut, 580 J/m2 für den Dünndarm, 450 J/m2 für den Magen, 570 J/m2 für die Muskulatur, 340 J/m2 für das Herz und 190 J/m2 für den Magen). m2 für Leber) [24]. Überbrückende Polymer-Chitosan-basierte Adhäsion weist auch eine gewebebezogene Adhäsionsenergie auf (etwa 10 J/m2 für die Leber, etwa 25 J/m2 für das Herz, etwa 35 J/m2 für die Arterie und etwa 90 J/m2 für die Haut) [27]. Die gewebeabhängige Grenzflächenzähigkeit ist ein komplexes, mit Biochemie und Mechanik verbundenes Problem, das noch weitgehend unerforscht ist. Es gibt jedoch eine allgemeine Hypothese, dass die gewebeabhängige Adhäsionsleistung mit den mechanischen Eigenschaften der Gewebe und ihren Grenzflächeninteraktionen mit den Hydrogelen zusammenhängt [45].

ACPs zeigten außerdem eine ausgezeichnete Biokompatibilität, vergleichbar mit kommerziellen Fibrin-Gelen. Die biologische Abbaubarkeit wurde durch Enzymlösung, Gewebeadhäsionstest und In-vivo-Experimente validiert. Aufgrund der biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität haben ACPs potenzielle Anwendungsmöglichkeiten für die Arzneimittelabgabe und Wundbehandlung. ACPs sind durchaus geeignet und haben Vorteile in medizinischen Situationen, in denen das Gewebe schwer verletzt oder disseziert wird und verschiedene begrenzte und unregelmäßige Defekte aufweist. Wir haben die Anwendung von ACPs bei der Reparatur einiger schwer verletzter Organe und der Darmanastomose demonstriert. Obwohl wir das spezifische Krankheitsmodell nicht definiert haben, eignet sich das chirurgische Verfahren der seitlichen Darmanastomose für Krankheiten, die eine Segmentresektion zur Darmrekonstruktion erfordern, wie Darmtumoren, entzündliche Darmerkrankungen und Darmperforationen [46,47,48]. . Auch andere unerforschte Organe und sogar Knorpelgewebe können durch ACPs repariert werden. ACPs können bei weiteren chirurgischen Eingriffen eingesetzt werden, einschließlich lumbaler Diskektomie und Bandwiederherstellung sowie gastrointestinaler und pankreatischer Anastomose. Bei perkutanen Verletzungen, wenn Muskeln und Haut betroffen sind und die Gewebeoberflächen gleichmäßig sind, könnten Klebebänder und einige kommerzielle hämostatische Produkte die bessere Wahl sein. Darmverletzungen kommen in Kriegszeiten häufig vor und erfordern dringende diagnostische Maßnahmen und Notfallbehandlungen [49]. ACPs bieten aufgrund ihrer einfachen Lagerung, hohen Tragbarkeit und einfachen Herstellung eine günstige Lösung für die Rettung auf dem Schlachtfeld und die präklinische Versorgung von Darmverletzungen. Darüber hinaus sind Mediziner an vorderster Front in der Lage, Darmdefekte mit ACPs und minimaler Schulung in wenigen Minuten zu schließen.

Die Studie weist einige Einschränkungen auf. Obwohl wir festgestellt haben, dass die Adhäsionsenergie für verschiedene Gewebe unterschiedlich ist, misst die aktuelle Studie lediglich die Adhäsionsenergie an mehreren Schweineorganen. Für weitere Anwendungen sollten zusätzliche Adhäsionsleistungen an mehr Geweben gemessen werden. Zweitens ist das Tempo der Verschlechterung bei den bestehenden AKP-Staaten nicht veränderbar; Es gibt jedoch einen alternativen abbaubaren Vernetzer, und die Abbaurate sollte durch Austausch der Vernetzer angepasst werden. Drittens werden alle Tiere nach ACP-bezogenen Eingriffen nur zwei Wochen lang beobachtet. Für umfassende biologische Bewertungen sind zusätzliche Langzeituntersuchungen erforderlich. Viertens können überschüssige ACPs, die sich durch unvorsichtige Handhabung über den Defektbereich hinaus ausbreiten, in der chirurgischen Praxis zu Verklebungen im Bauchraum und sogar zu Darmverschluss führen. ACPs erfordern präzisere Methoden zur Dosierungskontrolle, und elektrostatisches Sprühen ist eine potenziell wirksame Methode.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ACPs überlegene mechanische Eigenschaften, Biokompatibilität mit Geweben und Haftung an beliebigen Oberflächentopographien aufweisen. ACPs bieten eine mögliche Methode zur Überbrückung von Geweben in zukünftigen therapeutischen Verfahren. Der schnelle Ansatz zur Reparatur begrenzter und unregelmäßiger Gewebedefekte durch ACPs könnte eine Grundlage für weitere Studien zu Strategien zur Rettung auf dem Schlachtfeld bilden.

Die in der aktuellen Studie verwendeten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Acrylsäure

Acrylamid

Klebende Kryogelpartikel

Menschliche Darmepithelzellen

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco

Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskop

Granulationsgewebe

Hochleistungsfeld

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Menschliche normale Leberzellen

Lymphozyt

N,N'-Methylenbisacrylamid

Monozyten

Neutrophil

N-Hydroxysuccinimid

Rasterelektronenmikroskopie

Skelettmuskulatur

Ultraviolett

Weiße Blut Zelle

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Prof. Zhen Gu, Prof. Tao Xie und Prof. Hao-Fei Zhou von der Zhejiang-Universität für ihre hilfreichen Ratschläge. Die Autoren danken Prof. Bao-Hua Ji und Guang-Song Xie für die technische Unterstützung des konfokalen Mikroskops.

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (12102388, T2125009, 92048302), dem National Key Research and Development Program of China 2017 (YFA0701100) und Fundamental Research Funds for the Central Universities (226-2022-00141, 2022QZJH52) unterstützt ).

Yao-Ting Xue, Ming-Yu Chen und Jia-Sheng Cao haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen

Abteilung für technische Mechanik, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310027, China

Yao-Ting Xue, Lei Wang, Si-Yang Li, Xin-Ge Li, Kai-Hang Zhang, Xu-Xu Yang, Tie-Feng Li und Wei Yang

Schlüssellabor für Soft Machines und Smart Devices der Provinz Zhejiang, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310027, China

Yao-Ting Xue, Lei Wang, Si-Yang Li, Xin-Ge Li, Kai-Hang Zhang, Shu-Qiang Hao, Xu-Xu Yang, Tie-Feng Li und Wei Yang

Zentrum für X-Mechanik, Abteilung für technische Mechanik, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310027, China

Yao-Ting Xue, Lei Wang, Si-Yang Li, Xin-Ge Li, Kai-Hang Zhang, Tuck-Whye Wong, Xu-Xu Yang, Tie-Feng Li und Wei Yang

Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Sir Run-Run Shaw Hospital, Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310016, China

Ming-Yu Chen, Jia-Sheng Cao, Jia-Hao Hu, Ji-Liang Shen, Sarun Juengpanich und Xiu-Jun Cai

Soft Intelligent Materials Co., Ltd, Suzhou, 215123, China

Si-Bo Cheng

School of Biomedical Engineering and Health Sciences und Forschungszentrum für fortgeschrittene Membrantechnologie, Universiti Teknologi Malaysia, 81310, Skudai, Malaysia

Tuck-Whye Wong

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XXY, TFL und YTX waren an der Konzeption der Studie beteiligt. YTX und XXY haben die Materialien und die Methode für die klebenden Kryogelpartikel erfunden. YTX, XXY, SYL, SQH und LW führten die mechanischen Tests und Analysen durch. JSC, MYC, JHH, JLS und SJ konzipierten und führten die In-vitro-, Ex-vivo-Experimente und In-vivo-Rattenstudien durch. MYC, JSC und JLS haben die In-vivo-Kaninchenstudien entworfen und durchgeführt. YTX, KHZ, SBC und XGL halfen bei der Visualisierung der Daten. XXY, YTX, JSC und MYC haben das Originalmanuskript geschrieben, und XJC, TFL, WY und TWW haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. YXX, TFL, MYC, XJC und WY überwachten das Projekt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Xu-Xu Yang.

Alle Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Zhejiang-Universität (#ZJU20220181) genehmigt und die postoperative Versorgung wurde von den Mitarbeitern des Tierversuchszentrums des Sir Run-Run Shaw Hospital der Zhejiang-Universität überwacht.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

: Abb. S1. Vorbereitung von ACPs. Abb. S2. Adhäsionsenergietest verschiedener durch ACPs verbundener Gewebe. Abb. S3. Rasterelektronenmikroskopbilder von Adhäsionsschnittstellen von ACPs. Abb. S4. M-Transmissions-FTIR-Spektrum von ACPs. Abb. S5. Quantifizierung des Restmonomers in ACPs mittels HPLC Abb. S6. Konfokalmikroskopische Bilder des Lebend-/Tot-Assays von LO2 und Caco-2. Abb. S7. Das Ergebnis der Blutanalyse der Ratten 2 Wochen nach der dorsalen subkutanen Implantation. Abb. S8. Die Blutanalyseergebnisse von Ratten nach zweiwöchigen Leberoperationen. Abb. S9. Die Blutanalyseergebnisse von Kaninchen nach 2-wöchiger Darmanastomose. Abb. S10. Histologische Untersuchung des Kaninchendünndarms und der Rattenleber in vivo. Abb. S11. Bildung und Abbau des Polymernetzwerks von ACPs. Abb. S12. Mechanische Eigenschaften des mit Chitosan vernetzten PAAc-Hydrogels. Abb. S13. Mechanische Eigenschaften von Hydrogelen durch Aggregation von ACPs in Wasser. Abb. S14. Ex-vivo-Demonstration der Anwendungen von ACPs. Abb. S15. Zugtest des rekonstruierten Schweinedickdarms mittels Naht und ACPs. Abb. S16. Berstdruck des rekonstruierten Schweinedickdarms durch Nähen und ACPs. Abb. S17. Prävention von Bauchadhäsionen bei seitlicher Darmanastomose mit ACPs für ein In-vivo-Kaninchenmodell.

Zusatzdatei 2: Reparatur der geschädigten Schweineleber durch ACPs ex vivo.

Zusatzdatei 3: ACPs überbrücken eine blutende Rattenleber in vivo.

Zusätzliche Datei 4: Reparatur eines durchbohrten Schweinemagens durch ACPs ex vivo.

Zusatzdatei 5: Reparatur eines abgeschnittenen Schweinedarms durch ACPs ex vivo.

Zusätzliche Datei 6: Seitliche Darmanastomose durch ACPs in vivo.

Zusatzdatei 7: End-to-End-Darmanastomose durch ACPs in vivo.

Zusatzdatei 8: Berstdruck im Schweinedarm, überbrückt durch ACPs und Nähte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xue, YT., Chen, MY., Cao, JS. et al. Klebende Kryogelpartikel zur Überbrückung enger und unregelmäßiger Gewebedefekte. Military Med Res 10, 15 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00451-1

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Eingegangen: 06. Oktober 2022

Angenommen: 05. März 2023

Veröffentlicht: 23. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00451-1

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